Основные преимущества CARS метода спектроскопии

Интуитивно понятное программное обеспечение NanoSP для работы с микроскопом

Применение многофункционального микроскопа-спектрометра Confotec® CARS

Программный комплекс NanoSP предназначен для получения, обработки и идентификации спектральных данных при работе со сканирующими Рамановскими микроскопами серии Confotec®. NanoSP – это современное программное обеспечение c интуитивно понятным пользовательским интерфейсом, отличающееся простотой в использовании и обеспечивающее:

•  Контроль всех автоматизированных узлов и модулей микроскопов серии Confotec®.
•  Проведение спектральных измерений в выбранном месте образца.
•  Получение одномерных, двухмерных или трехмерных карт образца, используя отраженный лазерный свет или рамановский сигнал.
•  Обработку и анализ полученных экспериментальных данных.

Confotec® CARS – это многофункциональный многоканальный 3D сканирующий лазерный микроскоп-спектрометр. Confotec® CARS предназначен для одновременного и многофункционального анализа: построения высококонтрастных изображений с помощью CARS сигнала; конфокальных Рамановских изображений; конфокальных флуоресцентных изображений; конфокальных изображений в отраженном лазерном излучении и т.д.

Оптический стол

Все части расположены на оптической плите, установленной на виброгасящих опорах.

Современная нелинейная спектроскопия, кроме информации о новых нелинейных параметрах вещества, открывает принципиально новые возможности извлечения данных, являющихся традиционным предметом линейной спектроскопии — данных о положении и структуре спектральных линий, сечениях рассеяния, молекулярных уровнях энергии и вероятностях переходов. Хотя нелинейная спектроскопия в принципе имеет дело с бесконечным числом новых параметров – нелинейных восприимчивостей различных порядков, фактически в большинстве применяемых методов, например, нелинейная поляризационная спектроскопия, спектроскопия двухфотонного поглощения, когерентная антистоксовая рамановская спектроскопия, исследуются резонансы в кубичной нелинейной восприимчивости, которая стала одной из важнейших характеристик материальных сред. Кубичная нелинейная восприимчивость X⁽³⁾ является тензором 4-го ранга, отлична от нуля в центральносимметричных средах: в газах, жидкостях, аморфных твердых телах и кристаллических твердых телах.

Когда на нелинейную среду с отличной от нуля нелинейной восприимчивостью третьего порядка X⁽³⁾ падают две согласованные по времени и по пространству световые волны: E(vp), большей частоты v_p (волна «накачки») и E(v_s), меньшей частоты v_s («Стоксова» волна), они взаимодействуют друг с другом, вызывая биения электромагнитного поля на частоте v_p — v_s. В случае их резонанса с колебательным состоянием определенной химической связи среды v_p — v_s = v_vib происходит вынужденное рассеяние второго фотона волны накачки E(v_p) на сфазированном колебательном состоянии v_vib с генерацией новой волны E_CARS (2v_p — v_s), анти-Стоксовой волны с частотой (2v_p — v_s ), большей частоты v_p и Стоксовой частоты v_s.
​
Когерентное анти-Стоксово Рамановское рассеяние (coherent anti-Stokes Raman Scattering — CARS), является вынужденным процессом Рамановского (комбинационного) рассеяния, когда молекулярные колебания фазируются внешним излучением и рассеивают это излучение в анти-Стоксову область.

• Уровень сигнала в CARS спектроскопии может превосходить уровень, достижимый в спектроскопии спонтанного Рамановского рассеяния в 10⁴-10⁵ раз.

• То обстоятельство, что частота антистоксовой волны v_as » v_p, v_s, т.е. является наибольшей, позволяет использовать фильтры, отсекающие как падающее лазерное излучение, так и возможную флуоресценцию.

• Малая расходимость пучка дает получать хорошее пространственное разделение от фона флуоресценции для хемилюминесцирующих образцов или теплового излучения, которое присутствует в пламенах, разрядах.

• Основной вклад в генерацию антистоксового излучения происходит из малого объема вблизи фокуса двух лазерных пучков. Поэтому достаточно использовать образцы, содержащие малое количество вещества. Кроме того, благодаря этому можно изучать пространственное распределение молекул на определенных колебательно-вращательных уровнях с высоким пространственным разрешением.

Без использования спектрометра можно получить высокое спектральное разрешение. В CARS спектроскопии коллинеарной геометрии доплеровская ширина девяностоградусной спектроскопии спонтанного рассеяния уменьшена в v_p / v_p-v_s раз.

Диаграмма процесса когерентного анти-Стоксового Рамановского Рассеяния. Схема энергетических уровней показывает, что CARS включает взаимодействие четырёх волн с частотами: накачки vpump; стоксовой компоненты vs; пробной (зондирующей) волны vprobe; анти-стоксовой компоненты vCARS на колебательном резонансе vvib. Частота накачки и пробной волны – это одна и та же частота νpump = νprobe, задаваемая лазером накачки.

CARS часто сравнивают с вынужденным комбинационным рассеяниям света, а также со спонтанным рамановским рассеянием. CARS соединяет в себе преимущества сильного сигнала вынужденного рассеяния с широкой областью применимости Рамановской спектроскопии. Интенсивность вынужденного комбинационного рассеяния на несколько порядков выше интенсивности спонтанного Рамановского рассеяния, однако оно наблюдается только при интенсивности выше пороговой, которая зависит от коэффициента поглощения среды и величины производной от поляризуемости. Это ограничивает возможность наблюдения вынужденного рассеяния только наиболее сильными в комбинационном рассеянии линиями веществ с высокой плотностью.

В отличие от Рамановского рассеяния, когда свет рассеивается во всех направлениях, анти-Стоксов сигнал сохраняет направление, задаваемое падающими волнами, и при определенных условиях стимулирует другие фотоны рассеиваться в том — же направлении, когерентно накапливая сигнал. Подобно лазерному излучению фотоны анти-Стоксова сигнала сфазированы друг с другом, распространяются в фазово-согласованном направлении и поэтому легко детектируемы. В отличие от микроскопии, основанной на линейных процессах излучения и генерации изображения, где интенсивности сигналов линейно связаны с мощностью лазера, CARS сигнал порождается на основе нелинейных процессов 3-его порядка и имеет более сложные, нелинейные зависимости от интенсивности падающего излучения. Сигнал CARS пропорционален квадрату интенсивности волны накачки и прямо пропорционален интенсивности Стоксовой волны, а также квадрату всех вкладов в тензор X(³), так что X(³) включает сумму откликов всех молекул, присутствующих в зоне взаимодействия в фокальной перетяжке лазерного излучения, и соответственно CARS пропорционален квадрату концентрации молекул, вносящих вклад в X(³). Это позволяет, при определенных условиях, наряду с селективностью и неинвазивностью метода, использовать CARS для количественных измерений концентрации химической субстанции в образце.

Казалось бы, что Рамановская спектроскопия и CARS спектроскопия должны иметь одинаковую чувствительность, поскольку они используют одинаковые молекулярные переходы. Однако CARS сигнал намного интенсивнее (~10⁵), чем спонтанный Raman сигнал, кубически зависит от мощности возбуждения, обладает эффектом накопления в направлении фазового синхронизма и по свойствам близок к свойствам лазерных сигналов. Это позволяет существенно снизить время накопления сигнала (до единиц микросекунд на пиксель) и обеспечить неразрушающий анализ в реальном масштабе времени, что практически невозможно в других типах построения изображений — конфокальной флуоресцентной микроскопии или Раман микроскопии.

CARS сигнал генерируется в направлении, определяемом условием фазового синхронизма. В коллинеарном случае CARS сигнал совпадает по направлению с направлением лазерного излучения. CARS сигнал, распространяющийся в попутном направлении с возбуждающим излучением, называют F-CARS (Forward CARS). F-CARS сигнал складывается из резонансного и нерезонансного сигналов. Нерезонансный сигнал (фон) является результатом далеких от резонанса переходов, для которых сигналы тоже когерентно складываются. Резонансная амплитуда имеет фазовый сдвиг π радиан от резонанса, в то время как нерезонансная часть сигнала не имеет фазового сдвига. По этой причине форма спектральной линии CARS напоминает профиль Фано (Fano profile), который сдвинут по отношению к рамановскому сигналу. Величина нерезонансного фона, как правило, невелика и зависит от природы исследуемого объекта. Однако при низкой концентрации вещества резонансная часть сигнала уменьшается, а присутствие нерезонансного фона становится возрастающей проблемой. Чувствительность ограничивается разностью между резонансной и нерезонансной частями CARS сигнала.

Одним из способов подавления нерезонансного фона при регистрации CARS сигналов является поляризационно-чувствительное детектирование (Р- CARS), использующее разность поляризаций резонансных и нерезонансных сигналов. Это позволяет повысить контраст и улучшить качество изображения CARS.

Когда CARS детектируется в обратном направлении (Epi CARS), нерезонансный сигнал отсутствует. Но интенсивность E-CARS сигнала невелика по сравнению с F-CARS сигналом, потому что E-CARS генерируется с очень малого объема из-за деструктивной интерференции. E-CARS чувствителен к небольшим объектам, находящихся непосредственно в фокусе, размеры которых меньше оптической длины волны.

В определенных условиях, когда образец является сильно рассеивающим или, часто, когда образец подсыхает, F-CARS сигнал может рассеиваться в обратном направлении, давая сильный E-CARS сигнал.